«Fertilizantes nitrogenados alternativos: Estudios de ingeniería metabólica de la excreción de amonio
en bacterias diazotróficas»
Trabajo de tesis para optar por el título de: Doctor en Ciencias (Área Biología)
FCEyN – UNMdP
Autor: Lic. Ambrosio, Rafael
Director: Curatti, Leonardo
Lunes 4 de mayo de 2026, 10:00 a.m.
Lugar: Aula Adriana Excoffon (Aula 35) . FCEyN, UNMdP
Transmisión: en vivo a través del canal de YouTube de la FCEyN – UNMdP
Este trabajo explora el uso de bacterias fijadoras de nitrógeno como alternativa a los fertilizantes sintéticos, mediante estrategias de ingeniería metabólica orientadas a promover la excreción de amonio. Se desarrollaron cepas de Azotobacter vinelandii con control
regulado de la actividad de la glutamina sintetasa y, adicionalmente, se incorporó una modificación para lograr la expresión constitutiva de la fijación de nitrógeno. Estas cepas fueron capaces de fertilizar microalgas y plantas en ausencia de fertilizantes nitrogenados. Los resultados muestran que es posible controlar la liberación de amonio y el crecimiento bacteriano, aunque se evidencian limitaciones relacionadas con la estabilidad fenotípica y la competencia en distintos ambientes. Estas estrategias constituyen una base con potencial traslacional para el desarrollo de biofertilizantes más eficientes y sustentables.
Se explora el potencial de la fijación biológica de nitrógeno (FBN), realizada por un reducido grupo de bacterias y arqueas, como una alternativa a los fertilizantes sintéticos de nitrógeno. El reemplazo de al menos una parte de estos fertilizantes por alternativas ambientalmente más amigables y menos contaminantes promueven un desarrollo de la agricultura más sostenible. La utilización de la FBN ha logrado avances significativos, principalmente aprovechando la simbiosis entre rizobios y leguminosas; sin embargo, esta asociación específica lo limita para otros cultivos de interés agronómico. Por estos motivos, la fijación no simbiótica de N2 aumentaría la versatilidad de los biofertilizantes nitrogenados para extender los beneficios de la FBN a otros cultivos convencionales y no convencionales, como las microalgas.
La manipulación de la regulación de la fijación y asimilación del nitrógeno en bacterias diazotróficas de vida libre, como Azotobacter vinelandii, ha mostrado potencial como biofertilizante nitrogenado, liberando cantidades variables de nitrógeno. Entre las principales vías de modificación propuestas se encuentran: 1) la desregulación de la fijación biológica del nitrógeno por expresión constitutiva de la nitrogenasa; 2) la disminución de la actividad glutamina sintetasa (GS) y 3) la modificación del transportador de amonio AmtB para favorecer la liberación de amonio al medio. Estas estrategias tienden a incrementar los niveles de amonio intracelular y promover su liberación al medio.
En esta tesis se generaron cepas mutantes en A. vinelandii reemplazando el promotor nativo de la GS con uno inducible (cepas trcP::glnA). Dependiendo de los niveles de inductor, estas pueden excretar amonio que afecta el crecimiento, o pueden crecer en detrimento de la excreción de amonio. Eliminar el gen nifL para una expresión constitutiva de los genes nif, permitió en estas cepas un aumento en la producción de amonio y un crecimiento independiente de la concentración del inductor. Cuando se introdujeron en un cultivo de microalgas sin otras fuentes de nitrógeno o carbono, las bacterias modificadas promovieron un prominente crecimiento de las algas. Además, mejoraron el crecimiento de plantas de pepino inoculadas sin fertilizante nitrogenado añadido, a diferencia de la cepa salvaje.
La capacidad de estas bacterias para fertilizar microalgas plantea preocupaciones sobre problemas de eutrofización a largo plazo. Las cepas trcP::glnA presentaron niveles variables de GS dependiendo del nivel de inductor, lo que permitió controlar los niveles de actividad GS, la proliferación de la bacteria y la liberación de amonio. Con niveles bajos de GS, la cepa fertilizó microalgas antes y en menor magnitud comparado con cepas con altos niveles de GS, que retrasaron la liberación de amonio, pero sostuvieron una mayor proliferación final de microalgas. Este control preciso de la fertilización por excreción de amonio y del crecimiento de algas es ventajoso para un uso de biofertilizantes nitrogenados ambientalmente amigables. Sin embargo, este control evidenció un cambio fenotípico inesperado. Con el tiempo, y dependiente de los niveles iniciales de GS, las cepas revirtieron a un fenotipo similar al de la cepa salvaje. Estos cambios también se observaron en otras cepas mutantes excretores de amonio, indicando la necesidad de más investigaciones en ingeniería genética para equilibrar eficiencia y seguridad.
Otro apartado de interés fue la evaluación de la aptitud competitiva de las cepas excretoras de amonio. Se observó que estas cepas presentan una menor aptitud competitiva frente a la cepa salvaje, posiblemente por la capacidad de esta de crecer a expensas del nitrógeno excretado. No obstante, las cepas trcP::glnA mostraron una aptitud competitiva variable, inicialmente excluyendo a la cepa salvaje y liberando amonio. A largo plazo, la cepa salvaje se recuperó y dejó de detectarse amonio. Este fenómeno es relevante para el desarrollo de biofertilizantes con mejor capacidad de competencia. Finalmente, en suelos, las cepas genéticamente modificadas presentaron una mejor estabilidad fenotípica, tanto cuando fueron inoculadas de manera individual, como coinoculadas con otras cepas, que incrementaron sustancialmente el nivel de nitrógeno del suelo y modificaron la especiación del mismo.
Las modificaciones genéticas presentadas en este estudio representan una prueba de concepto para el desarrollo de una nueva generación de biofertilizantes más eficientes, que permitirían canalizar el nitrógeno atmosférico de forma controlada hacia suelos y cultivos de microalgas. Esto optimizaría la fertilización de los cultivos y reduciría el impacto ambiental asociado a los fertilizantes tradicionales, promoviendo una agricultura más eficiente y sustentable.